文献解读 | 双波长超透镜：不用物镜也能检测单个荧光分子（Nature Communications 2024）
论文简介
这篇论文解读的是 Barulin 等人 2024 年发表于 Nature Communications 的工作：Dual-wavelength metalens enables Epi-fluorescence detection from single molecules（DOI: 10.1038/s41467-023-44407-4，开放获取，CC BY 4.0；期刊原文页；PMC 全文）。论文由法国艾克斯-马赛大学（Aix-Marseille Université）与韩国浦项科技大学（POSTECH）、成均馆大学合作完成：Aleksandr Barulin、Yeseul Kim 与 Dong Kyo Oh 为共同第一作者，Junsuk Rho 与 Inki Kim 共同指导。
一句话贡献：论文用一层厚度仅约半微米的氢化非晶硅（aSi:H）纳米柱超透镜，同时承担”635 nm 激发光聚焦”与”670 nm 荧光收集”两件事，在不使用显微镜物镜的落射荧光（epi-fluorescence）构型下，对水溶液中扩散的 Alexa 647 单分子完成了荧光相关光谱（fluorescence correlation spectroscopy, FCS）测量，并进一步实现单个荧光纳米颗粒的实时观测与尺寸识别。
单分子荧光检测为什么长期离不开高倍物镜
单分子荧光光谱是分子生物物理研究里最灵敏的检测手段之一，也是许多高灵敏度生物传感方案的底层技术：检测疾病标志物、观察单分子化学反应、追踪扩散动力学，都依赖”看到一个分子发一次光”的能力。这里最常用的读出方式就是 FCS——它不直接”拍照”单分子，而是记录焦点体积内荧光强度的随机涨落：分子靠扩散不断进出焦点，进来的越多、荧光越强，于是强度时间轨迹里藏着分子数、扩散时间与单分子亮度等信息。
这套方法对”焦点”的要求极为苛刻。衍射极限决定了共聚焦观测体积通常仍有约 0.5 fL（飞升）量级，折算下来要在纳摩尔浓度范围才能让体积内只出现几个分子；同时单分子信号强度取决于激发处的功率密度与荧光收集效率，而传统高数值孔径（numerical aperture, NA）显微镜物镜对荧光的收集率上限约为 44%。正因为如此，商用单分子 FCS 仪器里最昂贵、最笨重的部件往往就是那支高质量高 NA 物镜。
能不能用别的光学结构替代它？此前有两条探索路线：一是把结构缩小到纳米尺度，用零模波导、纳米天线等增强局域光场并压缩观测体积；二是在宏观显微镜里换掉个别镜片，例如金刚石纳米柱构成的浸没式超透镜（NA 可达 1.0 以上）已经能收集单个金刚石氮-空位（NV）色心的发射。但 NV 色心比普通有机荧光分子亮两到三个数量级、光稳定性也远好，而这类超透镜只在单一波长下作为”收集透镜”工作，并不能同时解决”激发”与”收集”两个波长的问题。真正难的是让同一片平面器件同时做到：足够高的 NA、足够高的聚焦效率，以及激发/发射两个波长都能正确聚焦——这正是本文要攻克的组合约束。
直观理解：一片超透镜干”物镜的两份工作”
落射荧光（epi-fluorescence）构型是单分子实验最常见的布局：显微镜物镜先把激发激光聚焦进样品，再沿同一光路收集分子发出的荧光，二向色镜把激发光和荧光分开。本文的思路非常直接——用一片超透镜顶替这支物镜，其余光路基本不变。
论文选用的荧光分子是 Alexa 647，它有两个关键波长：实验激光线 635 nm（激发）与荧光发射峰约 670 nm（收集）。普通折射透镜有材料色散，同一片玻璃透镜很难让 635 nm 与 670 nm 同时聚焦到同一个点；如果两束光的焦点不重合，激发体积与检测体积就会错开，FCS 的有效体积被拉长、单分子信号被稀释。超透镜的优势在于每个亚波长单元的相位可以由结构尺寸独立调控，理论上可以针对两个波长分别设计”理想相位图”，再让同一个单元同时逼近这两幅相位图。
图 1：双波长超透镜用于单分子检测。(a) 工作原理示意：超透镜把 635 nm 激光聚焦到荧光分子溶液内，并收集 670 nm 荧光；(b) Alexa 647 的荧光光谱，竖线标出超透镜的两个目标波长——激光线与 Alexa 647 发射峰；(c) 集成超透镜的时间分辨共聚焦系统：SP 为短通滤光片，λ/2 为半波片，DM 为二向色镜，LP 为长通滤光片，BP 为带通滤光片，SPAD 为单光子雪崩二极管。
从图 1a 可以读出这个器件的”双重身份”：对 635 nm 而言，它是一支把激光聚焦进溶液的物镜；对 670 nm 而言，它又是一支把分子荧光收集并准直回探测器光路的物镜。论文选择 670 nm 作为收集波长还有一层考虑：激发光波长与荧光谱带分离得越干净，探测器收到的离焦背景荧光就越少，这与后面会用到的时序门控、共聚焦针孔一起，共同压低噪声。
设计：两个波长的相位图，如何共存于单层纳米柱
超透镜的相位设计从普通的透镜相位公式出发：要让波长 λ 的光聚焦到焦距 f 处，位置 (x, y) 需要的相位为
$$\varphi(x,y)=\frac{2\pi}{\lambda}\left(f-\sqrt{f^2+x^2+y^2}\right)$$
对 635 nm 与 670 nm 分别代入，就得到两幅理论上理想的相位图。难点在于：每个纳米柱只有两个可调的平面内尺寸（柱宽 W 与柱长 L），却要同时逼近两幅相位图。论文用严格耦合波分析（rigorous coupled wave analysis, RCWA）对 W、L 从 80 nm 到 280 nm 以 5 nm 步长扫描，筛选出透过率高于 50%、转换效率高于 50% 的结构，再为每个位置挑选与两幅理想相位最接近的纳米柱，形成”匹配相位图”。这种利用柱宽、柱长两个自由度同时控制两个波长相位的方式，让双波长功能得以写进一层厚度约 500 nm 的结构里，而无需多层堆叠（多层方案通常伴随层间对准难题）。
表 1：论文双波长超透镜的关键设计与实测参数（数据来自论文正文与图注）
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 材料 | 氢化非晶硅（aSi:H）纳米柱，玻璃衬底 |
| 器件直径 / 焦距 | 500 μm / 330 μm |
| 有效数值孔径 | 0.6 |
| 纳米柱周期 / 高度 | 300 nm / 500 nm |
| 柱宽与柱长（扫描范围） | 80–280 nm（步长 5 nm） |
| 工作波长 | 635 nm（激发）/ 670 nm（发射） |
| 平均透过率 | 82.6%（635 nm）/ 83.5%（670 nm） |
| 同偏振转换效率 | 71.6%（635 nm）/ 76.2%（670 nm） |
| 实测聚焦效率 | 14.2%（635 nm）/ 37.1%（670 nm） |
| 焦斑 FWHM | 0.77 μm（635 nm）/ 1.03 μm（670 nm） |
器件用电子束光刻（electron beam lithography, EBL）在玻璃上制造：先以等离子体增强化学气相沉积镀 600 nm 厚的 aSi:H，再用铬做掩模干法刻蚀出纳米柱阵列。从光学显微图与扫描电子显微镜（SEM）图看，纳米柱边缘锐利、形状规整。实测焦斑中心位置在 330 μm 处，与设计焦距一致，说明有效 NA 确实约为 0.6；焦斑纵横比约 10，正好对应 FCS 拟合里使用的焦点体积纵横比。
图 2：超透镜设计。(a) 制造完成的超透镜明场光学显微图；(b)、(c) 超透镜中心与边缘区域的 SEM 图；(d) 双波长功能示意：激发体积与检测体积重叠，可最小化共聚焦有效体积并提供高效光收集；(e) 分子检测效率（MDE）随透镜 NA 与聚焦效率（FE）的变化（任意单位，绝对值取决于显微镜系统总透过率；此图中激发与收集波长的 FE 视为相同）。
为什么既要盯住 NA 又要盯住聚焦效率？单分子荧光信号可以拆成两步：激发端把分子泵到激发态的速率正比于焦点的激光功率密度，衍射极限下功率密度正比于激发波长的聚焦效率乘以 NA 的平方，即 $I_{\text{exc}} \propto \mathrm{FE_{exc}} \cdot \mathrm{NA}^2$；收集端能收到的荧光比例正比于发射波长的聚焦效率乘以立体角相关的收集项 $C_{\text{EF}} \propto \mathrm{FE_{em}}\left(1-\sqrt{1-(\mathrm{NA}/n)^2}\right)$，其中 n 是溶液折射率。两者相乘就是图 2e 里的分子检测效率（MDE）：NA 与聚焦效率任何一方掉下去，单分子信号都会迅速恶化。论文在扫描库里选结构时同时约束了透过率与转换效率，正是为了给这两个端都留出余量。
实验：把”分子路过”变成一条相关曲线
器件做好了，怎么证明它真的能测单个分子？论文把超透镜装进一台自制的时间分辨共聚焦落射荧光显微镜：635 nm 皮秒激光（脉宽约 120 ps）经超透镜聚焦进样品溶液，荧光沿同一光路返回，由二向色镜分出后经过 655–700 nm 带通滤光片进入单光子雪崩二极管（SPAD），再用时间相关单光子计数（TCSPC）记录。超透镜后面接了一支 f=200 mm 的消色差双合透镜用来匹配光束与成像，系统的有效焦距 6.45 mm，放大率约 31 倍，配合 80 μm 共聚焦针孔把焦点外的荧光挡掉。
单分子荧光还有一个”时间维度”可以用：荧光分子在纳秒尺度发出光子，而超透镜结构本身的背景荧光寿命更长。论文在数据处理时把 10 ns 窗口内的光子当作有效信号（时序门控），进一步压低长寿命背景。在这样的构型下，Alexa 647 浓度从 6 nM 一路稀释到 10 pM，每条时间轨迹记录约 10 分钟以积累足够的单分子事件。
FCS 的核心是计算强度时间轨迹的自相关函数。对三维布朗扩散模型，相关函数可以写成
$$G(\tau)=\frac{(1-B/F)^2}{N}\left(1+\frac{\tau}{\tau_d}\right)^{-1}\left(1+\frac{\tau}{\kappa^2\tau_d}\right)^{-1/2}$$
其中 B 是背景强度，F 是总荧光强度，N 是检测体积内的平均分子数，τ_d 是分子穿过焦点体积的扩散时间，κ 是焦点体积纵横比（此处取 10）。相关函数在零延时处的幅值直接给出分子数：$N=(1-B/F)^2/G(0)$；扣除背景后的总荧光除以分子数，就是单分子亮度 $\mathrm{CRM}=(F-B)/N$。
图 4：超透镜实现的单分子荧光检测。(a) 不同浓度 Alexa 647（PBS 溶液）的荧光强度时间轨迹；(b) 由 (a) 中时间轨迹得到的自相关函数，1 nM 与 6 nM 曲线乘以 3 以便观察；(c) 由 FCS 相关函数与背景数据直接得到的检测体积内分子数，误差棒为 FCS 实验标准差；(d) 有无甘油时 Alexa 647 的归一化 FCS 相关函数，60% 甘油中扩散时间因黏度增加约增大 14 倍；(e) 有无 60% 甘油时 Alexa 647 的荧光衰减数据。
图 4a 的时间轨迹里能隐约看到分子进出的”毛刺”，但真正严格的判据是图 4b 的相关函数：如果只有背景噪声而没有单分子涨落，相关函数就不会有正确的幅值和衰减时间。论文的验证链条很完整：浓度越高相关函数幅值越低（与 N 随浓度增加一致）；把超透镜离焦或移走后相关函数为零；扣除背景后，从 10 pM 样品拟合出的平均分子数只有约 1.7 个——这意味着平均不到两个分子在检测体积里时，系统依然能测出完整的扩散相关信号。分子数与浓度在约 1 到数千个分子的范围内线性相关，单分子亮度约为 50 counts/s。
另一个值得注意的数字是检测体积：由焦点处点扩散函数（PSF）推算的共聚焦有效体积约 56 fL，而 FCS 拟合出的表观体积约 280 fL，大了约 5 倍。作者把这部分”膨胀”归因于少量非衍射荧光光子的收集、激光穿过玻璃片与溶液引入的像差，以及残余色差——这也正是单分子检测中激发体积与检测体积需要尽量重合的原因。作为方法学验证，论文在 60% 甘油的高黏度溶液里重复测量：扩散时间增大约 14 倍，荧光寿命从 0.97 ns 增至 1.57 ns，与常规高 NA 物镜的对照测量一致，说明超透镜测到的是真实的分子扩散与荧光动力学。
对比与拓展：从单个分子到单个纳米颗粒
单分子灵敏度需要放在”常规光学到底做到什么程度”的坐标系里看。论文把超透镜与两类商用镜片做了同条件对比：NA=0.18 与 NA=0.54 的单片非球面镜，以及 NA 在 0.15–1.2 之间的消色差物镜。结果很有信息量：非球面镜虽然 NA 与超透镜相当甚至更高，但由于激发波长与发射波长的焦点严重不重合（单镜色差），在相同条件下完全达不到单分子灵敏度；消色差物镜中 NA 低于 0.25 的也无法检出单分子。相比之下，超透镜在单分子亮度、有效 FCS 体积与扩散时间等关键参数上全面超过 NA<0.5 的物镜；与 NA=0.5 物镜相比，它的有效体积接近物镜的总体趋势，单分子亮度与扩散时间仍略低。考虑到物镜是一摞镜片的组合，而这里只是单片厚度约 500 nm 的平面结构，器件体积比常规物镜小约两个数量级——“用平面光学替代中等 NA 物镜”的可行性由此得到直接验证。
单分子荧光检测的下一个自然问题是：能不能检测更大的”单个物体”？论文把同一种方法延伸到单个荧光纳米颗粒：CdSe/ZnS 量子点（水合直径约 11 nm，发射峰 655 nm）和两种包覆有机染料的塑料纳米颗粒（水合直径 110 nm 与 490 nm，发射约 680 nm），激发功率降到 100 μW 以避免光漂白。
图 6：单纳米颗粒检测与尺寸识别。(a) Alexa 647、量子点（QD）与包覆有机染料的塑料纳米颗粒（NP）的归一化 FCS 相关函数，顶部标出各自水合直径 D_h；Alexa 647 用 1 mW 激发，QD/NP 用 100 μW；(b) 扩散时间 τ_d 随水合直径的变化，黑线为按 Stokes–Einstein 扩散定律的线性拟合；(c) 单分子/单颗粒亮度（CRM）对比，误差棒为 FCS 实验标准差；(d) 各发光体的荧光衰减及其拟合曲线（QD 寿命长，激光重频设为 5 MHz）。
图 6a 的相关函数随水合直径增大而系统地向更长的时间平移，图 6b 里扩散时间与水合直径呈线性关系，符合 Stokes–Einstein 扩散定律的预期。也就是说，FCS 用”分子在焦点里待多久”来估计尺寸，而不是直接成像——这正是它能在远低于衍射极限的尺度上区分颗粒的原因，也是论文强调它对微塑料监测这类场景有价值的出发点：空间分辨的光学方法测亚微米塑料颗粒往往失效，而 FCS 给的是动态学尺度的水合直径。实验中 490 nm 颗粒给出超过 10 kcounts/s 的明亮荧光 burst；即使把样品稀释到检测体积内平均约 0.17 个颗粒，时间轨迹里仍能看到高于背景 shot noise 的单颗粒事件，说明这套系统不仅能做系综统计，也能实时追踪单个纳米颗粒的进出。
意义与展望
这篇论文的价值不在于把单分子检测的纪录再推高一点，而在于给出了一个反直觉的证明：一层半微米厚的平面结构，可以在不借助显微镜物镜的情况下，同时完成高 NA 激发聚焦与高效荧光收集，并测到平均不足两个有机荧光分子的 FCS 信号。此前近 NA=1 的超透镜虽然已经能收集单个 NV 色心的发射，但那类光源比 Alexa 647 这类有机分子亮得多、稳定得多，且只需处理单一波长；本文把问题放回了更苛刻的”水溶液有机荧光分子 + 激发/收集双波长”场景。超透镜的全部光路功能压缩在一个纳米柱层里，意味着单分子传感设备中最笨重、最昂贵的物镜可以被一片平面镜片替代，为便携式 FCS、即时检测与微塑料监测提供了具体可行的器件形态。
从原理验证走向实际应用，仍有待推进的方向很清楚。作者在论文中坦率地指出，单层超透镜的实测聚焦效率（635 nm 处约 14.2%）还明显低于设计转换效率，这部分差距来自”匹配相位”的近似与加工偏差，向聚焦效率、数值孔径与宽带工作能力三个方向的理论极限推进仍是后续主线；把双波长方案扩展为多波长或宽带方案，并把超透镜与手机显微镜、3D 打印 FCS 平台或硅光子芯片集成，则是走向手持设备的工程路径。对读者而言，这篇论文最有意思的启发或许是：光学器件”能干什么”往往不是由材料或工艺单独决定的，而是由”一个单元能独立调几个自由度”决定的——两个波长能共存于单层纳米柱，靠的正是每个柱子宽与长这两个独立旋钮。
参考资料
- Barulin A, Kim Y, Oh DK, Jang J, Park H, Rho J, Kim I. Dual-wavelength metalens enables Epi-fluorescence detection from single molecules. Nature Communications 15, 26 (2024). DOI: 10.1038/s41467-023-44407-4；期刊原文页；PMC 全文（开放获取，CC BY 4.0）。
- Huang T-Y, et al. A monolithic immersion metalens for imaging solid-state quantum emitters. Nature Communications 10, 2392 (2019). DOI: 10.1038/s41467-019-10238-5。
- Wenger J, Rigneault H. Photonic methods to enhance fluorescence correlation spectroscopy and single molecule fluorescence detection. International Journal of Molecular Sciences 11, 206–226 (2010). DOI: 10.3390/ijms11010206；PMC 全文（开放获取）。